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编号:10228910
食管癌组织端粒酶活性的研究
http://www.100md.com 《癌症》 2000年第2期
     作者:赵春芳 陈朝伦

    单位:赵春芳(新疆医科大学一附院病理科,新疆 乌鲁木齐 830054);陈朝伦(新疆医科大学一附院病理科,新疆 乌鲁木齐 830054)

    关键词:食管癌;端粒酶;PCR

    癌症000209

    【摘 要】目的:检测食管癌及周围非癌食管粘膜组织中端粒酶活性,了解食管癌发生可能的分子生物学基础。方法:应用TRAP法对33例食管癌及18例癌周正常食管粘膜进行端粒酶活性测定。结果:食管癌组织28例(84.8%)表达阳性,癌周组织2例(11.1%)表达阳性(P<0.05)。端粒酶活性表达与食管癌病人的性别,民族,肿瘤部位,分化程度,有无淋巴结转移等似乎无关。结论:端粒酶活化与食管癌发生有关,并可为食管肿瘤早期诊断与治疗提供可靠的指标与新的线索。

, 百拇医药     中图分类号:R737.1 文献标识码:A

    文章编号:1000467X(2000)02-0131-03

    Detection of telomerase activity in tumor tissues from patients with esophageal carcinoma

    ZHAO Chun-fang CHEN Zhao-lun

    (Department of Surgical Pathology,the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,P.R.China)

    【Abstract】 Objective:To detect the telomerase activity in human esophageal carcinoma and tumor adjacent tissues and investigate the possible molecular mechanism of esophageal carcinogenesis. Methods:Telomerase activities were examined in 33 cases of esophageal carcinomas and 18 tumor-adjacent tissues by TRAP assay. Results:Twenty-eight of 33(84.8%) cancer tissues and 2 of 18 (11.1%) tumor-adjacent tissues revealed clearly positive for telomerase activity. A significant difference of the expression rate of telomerase activity was found between carcinoma and tumor-adjacent tissue (P<0.05). No significant correlation was found between telomerase activity and sex,nation of patients,location,differentiated grade of tumor and lymph nodes metastasis Conclusion: The presence of telomerase activity may play an important role in esophageal carcinogenesis and it will offer a new clue for malignant lesion diagnosis and treatment.
, 百拇医药
    Key words:Esophageal carcinoma; Telomerase; PCR

    细胞无限分裂增殖是细胞恶性转化的重要生物学特性。新近研究表明:端粒酶的活化,使分裂的细胞染色体端粒维持一定长度,保持染色体的稳定性,细胞可以继续分裂增殖存活,从而形成肿瘤[1]。食管粘膜上皮的癌变与肿瘤形成可能与端粒酶活性变化有关,这方面国内外报道少见。我们采用TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocol)法对食管癌组织及癌旁组织进行了初步检测,以探索端粒酶活性改变在新疆食管癌发生发展中的作用与临床病理意义,为肿瘤早期诊断与有效治疗探索新的分子生物学途径。

    1 材料与方法

    1.1 病例及标本处理

    收集本院1998年食管癌患者手术标本33例,其中男16例,女17例,年龄41~72岁,平均年龄58.1岁,汉族15例,哈萨克族11例,维吾尔族7例。高分化11例,中分化18例,低分化4例(肿瘤分化标准采用国际上普遍采用的3级分类法)。手术切除新鲜标本,包括肿瘤组织及距离肿瘤边缘10cm以上正常食管组织,快速取材,液氮速冻后转至80℃低温冰箱中贮存备用。所有病例均经病理常规检查确诊。
, 百拇医药
    1.2 端粒酶提取

    每例标本取100mg组织,用冷的wash buffer(10mmol/L Hepes-KOH,1.5mmol/LMgCl2,10mmol/LKCl,1mmol/LDTT,pH7.5)清洗后,置于90mm组织研磨器中研磨成糊状,转至0.5ml离心管中,低温离心去上清后,立即加入200μl预冷的Lysis buffer(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EDTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/L β-Mercaptoethanol,0.5%CHAPS,10%Glycerol),混匀,冰浴匀浆物30分钟后,4℃,16000r/min离心20分钟,上清即所需提取液。

    1.3 端粒酶活性测定

    采用TRAP-ezeTM端粒酶测定盒(Oncor公司,美国)TRAP法检测端粒酶活性。反应体系48μl,含1μl50×dNTPs mix,1.0μlTs引物(5’-AATCCGTCG-AGCAGAGTT-3’),1.0 μl TRAP Primer mix(5’-CCCTTACCCTTACCCTT-ACCCTAA-3’),2Utaq酶,39.6μl dH2O,加端粒酶提取液2μl,加入2~3滴石蜡油后,转至PCR扩增仪(PTC,美国)30℃延伸30分钟后,马上转至94℃,然后进行PCR扩增,循环参数为94℃30秒,60℃30秒,共35个循环。每次检测均设阳性对照与阴性对照,以三蒸水作为阴性对照,阳性对照试剂盒内已提供。反应结束后,取15μl反应产物加5μl上样缓冲液经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳4~5小时,电压125V,电泳结束后,将凝胶置10%乙醇固定3分钟,再用1%硝酸浸胶3分钟后,0.2%硝酸银染胶20分钟后,在显影液(80mlH2O,20ml 1.4MNa2CO3,50μl甲醛)中显色至全部条带显色而背景不过高为止,再行10%冰乙酸固定3分钟,将胶用保鲜膜包裹后作永久保存。
, 百拇医药
    1.4 统计分析

    采用四格表的χ2检验,四格表的确切概率法进行统计分析,P<0.05为差别有统计学意义。

    2 结果

    2.1 食管癌及癌旁组织中端粒酶活性表达

    端粒酶阳性表达者为间隔6bp的梯形图像(图1)。33例食管癌中检出端粒酶阳性者28例,阳性率为84.8%,癌旁组织阳性率为11.1%(2/18),其差别具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

    图1 食管癌端粒酶活性检测结果

    1.2.4.5:食管癌组织标本;
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    3:阳性对照;6:阴性对照

    表1 食管癌与癌旁组织中端粒酶活性的表达 组别

    n

    阳性数

    阳性率(%)

    χ2

    P值

    食管癌

    33

    28

    84.8

    癌旁组织
, 百拇医药
    18

    2

    11.1

    26.15

    <0.05

    合计

    51

    30

    58.8

    2.2 端粒酶与食管癌患者的关系

    端粒酶与食管癌性别,民族,部位,分化程度以及有无淋巴结转移等无关(P>0.05)(表2)。表2 端粒酶在不同临床分组资料中的表达 临床资料
, 百拇医药
    n

    阳性数

    阳性率(%)

    P

    P值

    性别

    男

    16

    13

    81.3

    0.32

    >0.05

    女

, 百拇医药     17

    15

    88.2

    民族

    汉

    15

    12

    80

    0.29

    >0.05

    哈

    11

    9

    81.8
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    维

    7

    7

    100

    肿瘤部位

    食管上段

    5

    4

    80

    0.43

    >0.05

    食管中段

    19

, http://www.100md.com     15

    78.9

    食管下段

    9

    9

    100

    肿瘤分化程度

    高

    11

    11

    100

    0.19

    >0.05

, 百拇医药     中

    18

    14

    77.8

    低

    4

    3

    75

    淋巴结转移

    有

    12

    12

    100

    0.09
, 百拇医药
    >0.05

    无

    21

    16

    76.2

    3 讨论

    端粒是真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合物,人的端粒的重复序列为TTAGGG,其功能是稳定染色体末端,避免染色体重组和末端被降解,防止染色体复制时缩短。端粒合成有赖于端粒酶的参与。端粒酶(Telomerase TELM)是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白,能识别特定的端粒重复序列,并以自身RNA部分为模板,合成新的端粒重复序列并添加到染色体末端,从而保持端粒一定长度与染色体的稳定性,使细胞获得永生化,甚至转化为无限分裂增殖的癌细胞。端粒是1985年Greider和Blackburn首次从四膜虫细胞提取物中发现的,自从1994年Kim[2]等发展了TRAP法,使端粒酶活性测定得以临床推广应用,之后,多种肿瘤组织中端粒酶活性研究陆续见到报告,研究发现:人体绝大多数的恶性肿瘤细胞呈端粒酶阳性,而人体正常细胞(除人体生殖,某些淋巴细胞和造血干细胞外)却为阴性,提示端粒酶可成为恶性肿瘤的重要标志。在这些报道中,肺癌癌组织为80.1%(109/136),癌旁组织为4.4%(3/68)[3];肝细胞肝癌为84.8%(28/33),癌旁组织为4.5%(1/22)[4];前列腺癌中为84%(21/25),癌旁为12%(3/25)[5];乳腺癌中为93%(130/140),癌旁为3.6%(2/55)[6];胃癌为85%(56/66),癌旁为6%(4/66)[7]。而食管癌的端粒酶活性研究较少,Takubo[8]等检测了31例食管癌和92例正常食管粘膜组织,其端粒酶活性分别为87%(27/31),23%(21/92),他认为,由于端粒酶活性可在一定数量正常食管粘膜中检测到,故不能将端粒酶单独地作为的肿瘤特异性标记物。我们的研究结果表明食管鳞癌组织内端粒酶阳性检出率高达84.8%(28/33)与肝细胞肝癌,前列腺癌,胃癌相近[4,5,7],而癌旁组织也有11%为阳性,与其他人报告相似,这可能与部分癌旁正常组织存在增生,不典型增生等癌前病变有关。Ahn等[9]研究认为,端粒酶活性与年龄、性别、肿瘤分级、组织学分级及DNA位性等无关,我们的研究似乎也证实了这一点,但因标本例数较少,有待扩大样本含量进一步深入研究证实。
, 百拇医药
    由于端粒酶在恶性肿瘤中具有活性而在正常组织中或良性肿瘤中失活,因此可望在临床鉴别诊断和推测预后方面发挥足够的作用。Umbricht等[10]认为端粒酶活性可以在术前鉴别甲状腺的微小浸润癌和良性的甲状腺瘤,从而使美国每年可以避免14000强的甲状腺切除术,显著降低发病率和医疗费用。Nakatani[11]等认为端粒酶活性可以作为恶性脑肿瘤的标记物,而且在复发肿瘤中端粒酶由阴转阳的变化可作为恶性星形细胞肿瘤的预后指标。Scates等[12]通过检测人类前列腺中端粒酶活性发现,在前列腺癌中活性为88.9%(8/9),在前列腺肥大中为37.5%(6/16),而在正常前列腺中为0(0/11),他认为,端粒酶可作为前列腺肥大患者向前列腺癌发展的生物标志。

    同样,以端粒酶为靶点,筛选合适的治疗方式如端粒酶抑制剂等针对性地治疗恶性肿瘤也已引起人们的关注。Knazawa等[13]发现了一种锤头核糖酶(Hammer head ribozyme,telo RZ)可对抗人体端粒酶内RNA成分,使之降解。Chen等[14]认为3,叠氮胸甙三磷酸盐(3,azidothymiddine triphosphate AZTTP)可抑制端粒酶的活性。
, 百拇医药
    但是,从目前研究结果看,只能说明端粒酶与肿瘤确有密切关系,但这种关系的性质尚不清楚,端粒酶活性变化与肿瘤的发生和发展是伴随关系或是因果关系。端粒酶的表达是见于整个肿瘤的发展过程抑或是只见于某一阶段,抑制端粒酶是否会阻断肿瘤的发生,并可能产生其他什么副作用等问题,尚待进一步研究解决,之后,端粒酶的使用才能真正为发展肿瘤生物标记与治疗靶子开拓一个新的领域。

    新疆是食管癌的高发区,其病因与发病机理及分子生物学基础尚未阐明,我们所做的研究仅为食管癌的发病机理及治疗提供了一个新的突破点,但其最终的广阔应用前景,有待进一步探索与研究。

    通讯作者:Tel:86-991-4841491-2844

    E-mail:赵春芳:Gefffeng@mail.xj.cninfo.ent

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    收稿日期:1999-03-05;修回日期:1999-05-06, 百拇医药